Hibridación de los ácidos nucleicos. Fundamento teórico
Hibridación in situ
Se realiza sobre tejido, células o cromosomas localizados sobre un soporte sólido (portaobjetos). se visualiza por medios isotópicos, enzimáticos o con fluorescencia (evaluado en un microscopio). Permite identificar donde se produce la hibridación que detecta la alteración genómica o transcripcional. Los resultados pueden realizarse por marcaje con fluorescencia de la sonda (FISH) o cromogénico (CISH, SISH). Los usos más frecuentes en Patología molecular son la detección de amplificaciones (Ej. Her2 en cáncer de mama c-myc en linfoma de Burkitt), traslocaciones (linfoma folicular, linfoma del manto, sarcomas) y presencia de virus (Epstein-Barr, HPV).
Microarrays de ADN
Sirven para analizar el nivel de expresión de miles (o todos) los genes de una muestra.
El resultado del experimento es una "fotografia" del estado de expresión del ARN de los genes de la muestra (tumoral o normal)
utilidad en patología molecular
Detección de marcadores tumorales útiles para el pronostico y predicción de respuesta terapéutica de las neoplasia.
Detección de marcadores tumorales útiles para el dignostico y clasificación de las neoplasisa.
tipos principales
Los que usan fragmentos mas pequeños de ADN (oligonucleótidos)
Las que utilizan como sondas fragmentos de cDNA.
TÉCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIÓN:
I. Blotting
Northern blot
En este caso de ARN se separan por electroforesis
se forman complejas estructuras secundarias que dificultan la migración.
el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada.
se pueden observan grandes cantidades de ARNm
Southern blot
Se realiza tinción con bromuro de etidio para comprobar la calidad
los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido débil y desnaturalizados con NaOH
el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa
el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada
CGH
Técnica citogenética: para detectar cromosomas amplificados, especialmente tumores.
Dos muestras de DNA genómico (una tumoral y una normal) se marcan con diferentes fluorocromos y se hibridan simultáneamente sobre una extensión de cromosomas metafásicos
La alta resolución de esta técnica permite la detección de desequilibrios genómicos submicroscópicos
MODULADORES DE LA HIBRIDACIÓN
pH y productos químicos
El pH alto (pH>11) rompe los puentes de hidrógeno, por lo que se produce desnaturalización. Esto también pueden producirlo agentes químicos como la
urea y la formamida e incluso el agua destilada, que impide la neutralización de
los grupos fosfato de la molécula por sales de sodio y magnesio; al ser los grupos fosfato de marcado carácter negativo
Temperatura
La temperatura elevada rompe los puentes de hidrógeno y separa las hebras del ADN (desnaturalización). Esto ocurre alrededor de los 90º (temperatura de fusión). Cuando una solución de DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando lugar a la estructura inicial.
Complementariedad
Las dos cadenas de
polinucleótidos de la doble hélice están conectadas mediante uniones
hidrógeno entre bases. En condiciones normales, una G se une específicamente con una C, mientras que una A solamente se puede unir con una T. El par de bases GC tiene tres uniones hidrógeno, mientras que el par AT tiene solamente dos. Como consecuencia, se necesita más energía para
romper el par GC que el par AT
El hecho de que una cadena de ADN sea complementaria a la otra permite una reproducción exacta del material
genético; así, cada cadena puede servir como molde (“template”) para la síntesis de otra.
Definición
es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a
partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de un proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena.
permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos.
permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de
secuencia conocida (sondas)
